注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
2,2'-BiquilineN-苯基對(duì)苯二胺 98%環(huán)戊 Standard for GC，>99.5%（GC)

2-HydroxyquilineN-苯基對(duì)苯二胺 98%己內(nèi)酰胺 色譜固定液

Copper 8-quilinate1,3-雙(三氟甲基)-5-溴苯 97%2- Standard for GC（）

DMSO3,5-雙(三氟甲基)苯甲酰氯 97% 癸二酸二乙酯 standard for GC

MSM3-酸 97%鄰苯二甲酸二壬酯 standard for GC, ≥99.5% (GC)

DMSO-d6α,α,α-三氟苯乙酮 98%乙  Standard for GC, ≥99.9% (GC)

SDPα,α,α-三氟苯乙酮 99%二乙胺 超純級(jí),≥99.5%(GC)

Diphenyl sulfone丁炔二酸二甲酯 99%酸乙酯 GCS,≥99.5% (GC)

Sulfolane金剛烷 99.0%赤蘚紅B鈉鹽 Biological stain

n-Amyl ether2-金剛烷酮 98%曙紅Y,溶 Biological stain

4,4'-Azoxyanisole環(huán)己烷甲 97%乙二縮雙（鄰氨基酚） 98%

BHA偶氮二甲酸二異酯 95%甘油 色譜固定液

ODA溴化鎂（六） 98%正庚酸 Standard for GC

Diphenyl ether4-甲苯磺酰異酸酯 96%正庚 standard for GC, ≥98% (GC)

18-Crown-6碳酸二苯酯 99%甲基異酮 Standard for GC,>99.5% (GC)

alpha-PGME硫代乙酸銨 試劑級(jí),70%溶液間硝苯 standard for GC, ≥99.5% (GC)

亞油酸甲酯(>99.0%(GC)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))Glycogen Synthase (15B1) Rabbit mAbKIF5A/NKHC1  驅(qū)動(dòng)蛋白KIF5A抗體

1-戊烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))NuMA AntibodyKIF4A  沉默驅(qū)動(dòng)蛋白KIF4A抗體

1-己烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))MAGE-A3 (E9S4X) Rabbit mAbKIF3A  驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白3抗體

1-庚烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))HS1 (D83A8) XP® Rabbit mAb (Human Specific)KIF2B  有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白樣2B抗體

1-辛烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))ARC (D7Q3G) Rabbit mAbKIF20A/MKLP2  有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白樣2抗體

1-壬烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))Phospho-Glycogen Synthase (Ser641) AntibodyKIF1B  驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員1B抗體

1-癸烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))HS1 (D5A9) XP® Rabbit mAb (Rodent Specific)KIF17  驅(qū)動(dòng)蛋白家族KIF17抗體

1-十一烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))Phospho-PKC (pan) (gamma Thr514) (D6Y3D) Rabbit mAbKIF15  驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員15抗體

1-十二烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))Glycogen Synthase AntibodyKif14 protein  驅(qū)動(dòng)蛋白家族Member14蛋白抗體

1-十三烯(>99.5%(GC),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))PARN (A42) AntibodyKIF11/Eg5/TRIP5  驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白1抗體（甲狀腺激素受體相互作用蛋白5）
大豆RR/SS PCR檢測(cè)試劑盒廠家GTP發(fā)育調(diào)控結(jié)合蛋白1抗體20,24-Dihydroxydammar-25-en-3-one中文名：別名：分子式：C30H50O3

細(xì)胞骨架4.1蛋白家族DAL1抗體Cycloeucalel中文名：環(huán)桉烯醇別名：24-Methylene-29-rcycloartan-3β-ol分子式：C30H50O

跨膜蛋白16A/鈣激活氯離子通道抗體Piscidil A中文名：別名：分子式：C30H50O4

退行性精母細(xì)胞同源物1抗體Triptohypol F中文名：別名：分子式：C31H52O2

7脫氫膽固醇還原酶抗體1β,2α,3β,19α-Tetrahydroxy-12-ursen-28-oic acid中文名：別名：分子式：C30H48O6
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。