注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
(含檸檬酸鹽緩沖液)Mouse Vascular Endothelial Growth Factor-164 (mVEGF₁₆₄ )甲基-2-

純粉Mouse Vascular Endothelial Growth Factor-164 (mVEGF₁₆₄ )嗎啉-2-羧酸酯

AC-DC亞酰單體PCM-1 (G2000) Antibody巴豆酸

2,2'-脫水-5-甲基尿苷T-bet/TBX21 (V365) Antibody巰基酸

7-DEAZA-7--2'-脫氧鳥苷Mouse Inrleukin-6 (mIL-6)L-酪氨酸甲酯

7-Deaza-7-I-2’-dAMouse Inrleukin-6 (mIL-6)甲基-2-戊

2',3'-雙脫氧腺苷(ddA)Mouse Inrleukin-7 (mIL-7)2-氨基-5-甲基-1,3,噻二唑

木糖Mouse Inrleukin-7 (mIL-7)(硝基芐基)吡啶

木糖(標(biāo)準(zhǔn)品)Human Neuregulin-1 (hNRG-1)硫酚

2',3'-二脫氧胸苷(ddT)Human Neuregulin-1 (hNRG-1)甲

基-β-D-吡喃半糖苷HHLA2/B7-H7 (E1U6X) Rabbit mAbL-(+)-樟腦內(nèi)磺酰

2-氨基環(huán)Human β-Nerve Growth Factor (hβ-NGF)2,二甲基吡啶

Y-27632.2HClHuman β-Nerve Growth Factor (hβ-NGF)2,6-二甲基哌

靈芝酸A(標(biāo)準(zhǔn)品)Mouse Sm Cell Factor (mSCF)2,6-二甲基吡

惡唑甲酸酯Mouse Sm Cell Factor (mSCF)異胞嘧啶

2-基環(huán)戊酮Mouse Inrleukin-22 (mIL-22)草酰酸二酯

化酰膽鈣鹽Mouse Inrleukin-22 (mIL-22)甲醋酸酯

蝙蝠葛蘇林(標(biāo)準(zhǔn)品)Brg1 (E9O6E) Mouse mAb3,5-二酚

腎上腺素能受體β2/β2-ARphospho-CYLD(Ser418) /FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、微管結(jié)合蛋白CYLDIgG100 ul

晚期糖基化終末產(chǎn)物CCL15/MIP5/FITC  熒光素標(biāo)記巨噬細(xì)胞炎性蛋白15IgG100 ul

軟骨蛋白聚糖CCL16/HCC-4/FITC  熒光素標(biāo)記巨噬細(xì)胞炎性蛋白16IgG100 ul

5-氨基酰酸合酶1CCL17/TARC/FITC  熒光素標(biāo)記胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子IgG100 ul

p53凋亡刺激蛋白1ABCD1/MDC(small inducible cytokine A22 precursor)/FITC  熒光素標(biāo)記抗嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白2IgG100 ul

P53凋亡刺激蛋白2CCL23/MPIF-1/FITC  熒光素標(biāo)記骨髓抑制因子1IgG1 Kit

激活素受體2BCCL24/Eotaxin-2/FITC  熒光素標(biāo)記嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白24IgG100 ul

AIMP2CCL27/CTACK/FITC  熒光素標(biāo)記皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子IgG20 ul

酰膽酶CCL26/FITC  熒光素標(biāo)記抗嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白3IgG100 ul
沙門氏菌SPP-spec核酸試劑盒說明書上皮細(xì)胞膜蛋白3抗體CTU Guanamine中文名：別名：分子式：C17H26N10O4

腸道病毒71型/手足口病病毒抗體Bis[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl] sulfone中文名：雙[4-(2-羥乙氧基)苯基]砜別名：分子式：C16H18O6S

膜蛋白EVC2抗體Bis[4-(dimethylami)phenyl]methane中文名：雙[4-(二甲氨基)苯基]別名：分子式：C17H22N2

Emerin蛋白抗體4,4'-Bis(chloromethyl)biphenyl中文名：4,4'-雙(氯甲基)聯(lián)苯別名：分子式：C14H12Cl2

轉(zhuǎn)錄因子ELF1抗體2,2-Bis(hydroxymethyl)butyric acid中文名：2,2-二羥甲基丁酸別名：分子式：C6H12O4
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。